Нейтрофилы в системе иммунитета против опухоли
Хронология изучения роли нейтрофилов как в норме, так и при патологии показывает, что со временем взгляды И.И. Мечникова и P. Erlich в конечном итоге оказались в равной степени правомочными.
Очевидно, высокий авторитет этих великих ученых явился причиной того, что в течение длительного периода изучение нейтрофилов было преимущественно сконцентрировано на механизмах фагоцитоза и дегрануляции, характеристикой выделяемых субстанций с особым акцентом на роль последних в воспалении.
После некоторого спада внимания к исследованию нейтрофилов начало 1970-х годов стало периодом новой волны интереса к изучению этих, а также других фагоцитирующих клеток. Результатом этого явилось появление множества обзоров, монографий не только в зарубежной, а и в отечественной литературе.
Биологическая роль нейтрофилов
Изучение биологической роли нейтрофилов прошло большой и непростой путь, в котором можно выделить три этапа:
1) И. И. Мечников в 1898 г. определил нейтрофилы как клетки, основная функция которых — фагоцитоз; 2) P. Erlich в 1900 г. была дана иная оценка роли нейтрофилов, согласно которой их основная функция — дегрануляция и выделение различных продуктов; 3) с позиций современных представлений нейтрофилы рассматриваются как в высшей степени полифункциональная, гетерогенная популяция клеток с широким кругом регуляторных влияний.
Наряду с этим из приведенных в литературе данных указанного периода видно, что при обилии работ, посвященных изучению нейтрофилов, практически при всех заболеваниях человека с оценкой многих функций и механизмов их реализации одна из важнейших функций этих клеток — цитотоксичность — оставалась по-прежнему наименее охарактеризованной.
И если исследование антителозависимой цитотоксичности нашло достаточное отражение при различных инфекционных заболеваниях, а также при некоторой другой патологии, то интерес к этой функции нейтрофилов при опухолевом процессе оставался невелик, что проявилось в сравнительно небольшом объеме данных зарубежных исследователей и практически единичных публикациях в отечественной литературе.
К началу 1990-х годов литература существенно пополнилась данными о цитотоксических свойствах нейтрофилов в защите против злокачественно трансформированных клеток. Стали изучать и механизмы реализации цитотоксичности нейтрофилов в отношении опухолевых клеток, что в конечном счете позволяет сегодня рассматривать эти клетки и как важный компонент противоопухолевой защиты.
В ходе эволюционного развития нейтрофилы приобрели такие свойства, которые в настоящее время свидетельствуют об их уникальных возможностях, большом функциональном потенциале, широких адаптационных способностях. Такая оценка полностью оправдывает представление о них не только как о центральном компоненте первой линии антибактериальной защиты, но и как об активном участнике поддержания иммунологического гомеостаза в норме и при патологии.
Характеристика нейтрофилов
На поверхностной мембране нейтрофилов экспрессируются разнообразные антигены и рецепторные структуры. В частности, нейтрофилы экспрессируют антигены I и II классов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), а также антигены, большинство из которых является общим как для нейтрофилов, так и клеток других популяций: Т-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, естественных киллеров (ЕК), эпителиальных клеток и др.
Однако в последнее время идентифицирован антиген, который локализуется в плазматической мембране и вторичных гранулах, специфичен только для нейтрофилов и определен как HNA (CD177). Выделены две его изоформы — HNA-1 и HNA-2, изучена их биохимическая структура и идентифицированы кодирующие их гены.
Экспрессия этого антигена вариабельна и может увеличиваться при различных физиологических состояниях, например при беременности. Новые данные об изучении этого антигена показывают, что он экспрессируется только на одной субпопуляции нейтрофилов и его определение может иметь клиническое значение как маркера нейтропении.
Нейтрофилы экспрессируют и несколько раково-эмбриональных антигенов, которые относятся к суперсемейству иммуноглобулинов: NCA-160 (CD66a). Лигандом для этого антигена является Е-селектин поверхности некоторых бактерий; NCA-95 (CD66b) — молекула, которая принимает участие в гетерофильной адгезии; NCA-51/90 — участник гомо- и гетероадгезии (лиганды — различные селектины); GM-1 (CD66d) — участвует в активации нейтрофилов, адгезии и выполняет роль рецептора для некоторых бактерий.
В дегранулированных нейтрофилах, а также других фагоцитирующих клетках выявлен антиген, который представляет собой гликопротеин, ассоциированный с лизисом мембран — LAMP-3 (CD63); лигандами для него служат различные члены семейства интегринов.
Нейтрофилы экспрессируют множество поверхностных рецепторов: FcyRI, FcyRII (CD32), FcyRIII (CD 16) — низкоаффинный рецептор для IgG и FcyRIIIb (CD64) — лиганд для различных подклассов IgG.
FcccR (CD89) — лиганд для IgA; IgE-связывающий белок Мас-2/ВР; рецепторы для компонентов комплемента — CD88 (лиганд С5а), CD35 (лиганды С3b и С4b). На поверхности нейтрофилов экспрессируется и множество адгезивных молекул, среди которых в первую очередь следует отметить CDlla и CD1lb — лиганды для ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) и др.
В реализации многих функций нейтрофилов, в частности фагоцитоза и адгезии к эндотелиальным клеткам, активное участие принимает и комплекс CDl1b/CD18, который обладает способностью связываться со многими лигандами. Нейтрофилы также экспрессируют CD49f (лиганды — ламинины, инвазины и др.), CD147 и др.
Существуют определенные филогенетические различия в экспрессии нейтрофилами Fc-рецепторов, что показано при сравнительной оценке различных Fc-рецепторов новорожденных и взрослых лиц. В результате выяснено, что для нейтрофилов новорожденных характерен более высокий уровень экспрессии FcyRI и FcyRII и сравнительно невысокий — FcyRIII.
В активации многих функций нейтрофилов, в первую очередь цитотоксической активности, координирующую роль выполняет FcyRI. Более детальное рассмотрение этого вопроса представлено в разделе о цитотоксичности нейтрофилов. Роль FcR, который связывает IgA, изучена меньше, однако стало известно, что частицы, нагруженные IgA, при взаимодействии с FcRI индуцируют выделение медиаторов и фагоцитоз.
Нейтрофилы также экспрессируют: рецепторы для гистамина (HI, Н2, Н3, Н4), в-адренергические, к глюкокортикоидам GRa и GRb, различным хемотаксическим факторам, простагландинам, цитохрому В, лейкотриену LTB-4 и др. Наличие разнообразных рецепторов, благодаря которым нейтрофилы взаимодействуют с различными биологически активными веществами, послужило основанием к использованию нейтрофилов в качестве очень удобной модели для изучения механизма действия этих веществ.
Значительный интерес представляет экспрессия CD69, который, как выяснилось, служит не только маркером ранней активации Т-и В-лимфоцитов, но и экспрессируется нейтрофилами после их стимуляции различными стимулами, включая цитокины.
Сравнительная оценка результатов изучения влияния различных цитокинов на экспрессию CD69 (IL-lв, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-18, G-CSF, GM-CSF, TNFa, TGFp, IFNa, IFNy) показала, что самым мощным индуктором его экспрессии являются GM-CSF и интерфероны; авторы отмечают, что индукция экспрессии CD69 связана с синтезом нового белка, сопровождается продукцией и секрецией TNFa.
Новые данные свидетельствуют о том, что нейтрофилы содержат CD14 — рецептор для липополисахарида, который располагается внутриклеточно как преформированный белок и на поверхности нейтрофилов представлен несколькими цепями; экспрессия CD14, а также FcyRI заметно повышена при некоторых бактериальных инфекциях, однако роль CD14 в опухолевом процессе еще не изучена.
Нейтрофилы гетерогенны по своему составу, но в связи с тем что, как отмечалось выше, в настоящее время идентифицирован только один антиген, специфичный для нейтрофилов, доказательства гетерогенности по функциональным и морфологическим признакам доминируют.
В частности, нейтрофилы различаются по плотности цитоплазматического матрикса (светлые — сниженная плотность, темные — высокая плотность), способности экспрессировать различные рецепторные структуры, выделению продуктов гранул, характеру ответа на различные стимулы и др.
Примером последнего могут служить данные о сравнительной оценке действия TNFa и липополисахарида на адгезивные свойства нейтрофилов. Под влиянием TNFa адгезия нейтрофилов к эндотелиальным клеткам увеличивается, а под влиянием другого стимулятора — уменьшается.
Выяснение механизмов этих эффектов выявило, что если усиление адгезии под влиянием TNFa связано с активацией экспрессии адгезивных молекул ICAM-1 и VCAM-1, то под влиянием липополисахарида — их ингибицией.
В последнее время описан субтип нейтрофилов, экспрессирую-щих CD30 (член семейства рецепторов TNF), который выявлен и на других клетках (Т- и В-лимфоциты, ЕК, моноциты и др.). Вызывает интерес недавно установленный факт, согласно которому CD30 экспрессируют анапластические клетки, которые могут появляться как при злокачественных, так и доброкачественных опухолях; наличие СD30-положительных нейтрофилов может быть использовано при дифференциальной диагностике между лимфомами и доброкачественными опухолями кожи, характеризующимися инфильтрацией нейтрофилами и эозинофилами.
В первичных и вторичных гранулах нейтрофилов содержится большое количество различных субстанций, которые выделяются преимущественно в результате дегрануляции. Субстанции гранул нейтрофилов представлены различными ферментами и неферментными соединениями: миелопероксидазой, в-глюкуронидазой, различными нуклеазами (кислой рибонуклеазой, дезоксирибонуклеазой), нейтральными протеиназами, активатором плазминогена, ферментами свертывающей системы крови, кининазой, а- и в-фурозидазами, кислой липазой, кислой и щелочной фосфатазами, фосфолипазами А и В, лецитиназой А, гистаминазой и др.
В группу протеиназ также входят ферменты, разрушающие коллаген (эластаза, интерстициальная коллагеназа и желатиназа). Каждый из коллагеназных ферментов выделяется нейтрофилами экстрацеллюлярно и дифференцированно в зависимости от характера стимула, в потенцировании их действия играет роль желатиназа.
Наряду с указанной большой группой ферментов гранулы нейтрофилов содержат также бактерицидные белки: лизоцим, дефензины, лактоферрин, катепсин G, катионный антимикробный белок САР-57 и бактерицидный белок B/IP, повышающий проницаемость сосудов. Нейтрофилы также продуцируют LTB-4, LTC, LTD-4, LTE-4, а также другие субстанции.
В контроле экзоцитоза азурофильных гранул нейтрофилов важное место занимают TNFa и некоторые хемоаттрактанты, а также эндогенный аденозин, снижающий секреторный ответ. Весьма интересны данные о том, что нейтрофилы способны контролировать экзо-цитоз первичных гранул аутокринной регуляцией за счет изменения активности катепсина G.
Даже этот неполный перечень субстанций, продуцируемых нейтрофилами, свидетельствует об очень широких возможностях для участия этих клеток в различных процессах. Следует обратить особое внимание на большую группу ферментов, которые способны разрушать экстрацеллюлярный матрикс, что в первую очередь относится к метал-лопротеиназам (коллагеназам и желатиназе), а также к другим ферментам с протеолитической активностью.
Фагоцитоз микроорганизмов
Как отмечалось, одной из важнейших и наиболее изученных функций нейтрофилов является фагоцитоз микроорганизмов, что достаточно полно отражено в литературе. В общем представлении о физиологической роли нейтрофилов имеют значение и новые данные о том, что продукты метаболизма кислорода, выделяющиеся после стимуляции, способны оказывать нейтрализующее действие на микроорганизмы (подобным свойством обладают и макрофаги).
Представляют также интерес данные о том, что нейтрофилы убивают бактерии в первую очередь благодаря действию протеаз, активация которых происходит в результате резкого увеличения концентрации калия (активность процесса зависит от уровня рН). Несмотря на то что эти механизмы изучены при уничтожении микроорганизмов нейтрофилами, вполне вероятно предположить, что они могут быть реализованы и в отношении опухолевых клеток.
В функционировании нейтрофилов и поддержании их численности так же, как и других клеток, важную роль играет апоптоз, который рассматривается как необходимый физиологический процесс, регулируется различными механизмами. Как известно, одной из основных систем регуляции с участием апоптоза является Fas/FasL.
Многие нейтрофилы экспрессируют Fas, FasL и растворимую форму FasL. Экспрессия Fas и FasL на таких фагоцитирующих клетках, как нейтрофилы, моноциты, эозинофилы человека, происходит дифференцированно. Так, если Fas-антиген экспрессируется всеми типами указанных стимулированных клеток, то постоянная экспрессия Fas характерна только для нейтрофилов и поэтому зрелые нейтрофилы подготовлены к апоптозу ко-экспрессией Fas и FasL.
Наряду с Fas/FasL-системой, как известно, в апоптозе принимает участие и система TNFа/TNFa-R. Последние данные показывают, что эта система может не только индуцировать апоптоз, но и при отдельных условиях способствовать выживанию нейтрофилов.
В регуляции апоптоза нейтрофилов важное место занимают GM-CSF, G-CSF, IFNy, TNFa и глюкокортикоиды. Кроме того, апоптоз нейтрофилов регулируется и иммунными комплексами, которые его стимулируют.
Эта форма регуляции апоптоза нейтрофилов в одних случаях зависит от респираторного взрыва, в других — происходит независимо от него. Спонтанный и зависимый от иммунных комплексов апоптоз регулируется различно, при этом первый связан со снижением экспрессии антигенов I класса ГКГ.
Внутриклеточные механизмы апоптоза нейтрофилов в настоящее время раскрыты еще не в полной мере. Однако установлено, что факторы, которые повышают внутриклеточное содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и хорошо известны как снижающие функции нейтрофилов (ПГЕ2, ингибитор фосфодиэстеразы-4 и др.), обеспечивают им функциональную релаксацию, так как пролонгируют жизнь нейтрофилов путем замедления апоптоза.
В апоптозе нейтрофилов ключевая роль принадлежит каспазам-3 и -8, что принципиально отличает его от апоптоза других гранулоцитов, в частности эозинофилов, в регуляции апоптоза которых эти каспазы не имеют существенного значения.
В Fas-зависимом апоптозе нейтрофилов важная роль принадлежит экспрессии цитоплазматической молекулы А1 — белка, который постоянно экспрессируется нейтрофилами.
Исследование молекулярных механизмов апоптоза нейтрофилов свидетельствует, что рецепторы, содержащие домен смерти к лигандам семейства TNFa/NGF, могут индуцировать апоптоз во многих клеточных системах, а домены, содержащие тирозинфосфатазу (SHP-1) и инозитолфосфатазу (SHIP), могут связывать соответствующий мотив каспазозависимым и независимым путями; стимуляция рецепторов смерти прерывает антиапоптический путь, который инициируется факторами выживания нейтрофилов.
Нейтрофилы и эозинофилы экспрессируют функционально активные TRAIL-рецепторы: TRAIL-R1, TRAIL-R3 и TRAIL-R4. Данными последних лет выявлено, что нейтрофилы экспрессируют и TRAIL-R2. Вопрос о том, каково значение этих рецепторов, пока имеет дискуссионный характер.
Согласно одним авторам, TRAIL не индуцирует апоптоз нейтрофилов, однако при этом не исключается и альтернативный механизм — TRAIL может ограничивать антиапоптическое действие, индуцированное цитокинами, в частности при воспалении.
По мнению других авторов, при определенных условиях стимулированные нейтрофилы проявляют повышенную чувствительность к TRAIL, которая реализуется через TRAIL-R1 и TRAIL-R2. Это позволяет предположить, что TRAIL может быть механизмом регуляции удаления нейтрофилов из участков воспаления.
Существование таких различных взглядов на роль TRAIL в выживаемости нейтрофилов в настоящее время можно объяснить лишь новизной изучаемого вопроса и недостатком соответствующих фактов.
Замедление апоптоза является важнейшим механизмом накопления нейтрофилов — процесс, в котором главенствующая роль принадлежит GM-CSF и G-CSF. Антиапоптическим действием обладают и такие цитокины, как IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10. Действие всех антиапоптических факторов во многом зависит от степени зрелости нейтрофилов и уровня экспрессии указанных интерлейкинов.
К факторам, способным влиять на апоптоз нейтрофилов, относится и их взаимодействие с эндотелиальными клетками. В частности показано, что при указанном взаимодействии снижается экспрессия Fas, TNFa и TRAIL. Из этого следует, что уменьшение апоптоза при взаимодействии с эндотелиальными клетками может осуществляться различными апоптотическими путями.
Одна из важных особенностей регуляции уровня апоптоза нейтрофилов — очень выраженные динамичность и пластичность, благодаря чему уровень его может быстро изменяться в различных условиях: при бактериальных инфекциях, аутоиммунных и аллергических заболеваниях, опухолевом процессе.
Такие динамичность и многофакторность апоптоза нейтрофилов могут служить еще одним доказательством эволюционного совершенства становления функций нейтрофилов как клеток первой линии защиты против различных патогенов.
Существующие данные об апоптозе нейтрофилов, механизмах, причинах, его индуцирующих или ингибирующих, позволяют констатировать, что регуляция этого процесса зависит от множества факторов, среди которых важнейшими являются:
1) состояние самих нейтрофилов; 2) особенности цитокиновой регуляции; 3) состояние стромы (экстрацеллюлярного матрикса).
Последнее во многом объясняется тем, что гликопротеины экстрацеллюлярного матрикса значительно определяют ответ нейтрофилов и на различные медиаторы, способствуя их диффузии из участков, где находятся источники их продукции.
Перечисленные выше свойства нейтрофилов лежат в основе их мультифункциональности. В настоящее время известны следующие основные функции нейтрофилов: презентация антигена, дегрануляция, продукция цитокинов, фагоцитоз, цитотоксичность и адгезия.