Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему: Фитохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки винограда культурного (Vitis vinifera L.)

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фитохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки винограда культурного (Vitis vinifera L.)

На правах рукописи

ерёмина анастасия викторовна

фотохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки винограда

культурного (уггге ушшена ь.).

1S.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия.

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И М. Сеченова Министерства Здравоохранения и Социального развития РФ

доктор фармацевтических наук, Решетняк Владимир Юрьевич

доктор фармацевтических наук, Белобородое Владимир Леонидович

доктор фармацевтических наук Сокольская Татьяна Александровна

Институт государственного контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства Здравоохранения и Социального развитая РФ

Защита состоится «10» мая 2005 г. в «14» часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан «_»_ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время на Российском фармацевтическом рынке представлено большое количество лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) из лекарственных растений, не включенных в Государственную Фармакопею, но обладающих выраженной биологической активностью и полезными для здоровья человека эффектами. Ярким примером являются препараты на основе экстрактов Винограда культурного (Vitis vinifera £.,сем. Vitaceae).

Большая популярность препаратов винограда обусловлена их высокой фармакологической активностью и выраженными клиническими эффектами. История их появления связана с изучением полезных свойств красного виноградного вина и явлением, получившим название «французский парадокс», суть которого заключается в существенном снижении уровня сердечно-сосудистой заболеваемости в популяции на фоне традиционного высокого потребления продуктов виноделия. Экстракты винограда содержат комплекс полифенольных соединений, обладающих очень мощным антиоксидантным действием, по силе превышающем аскорбиновую кислоту в 20 раз и а-токоферол в 50 раз, благодаря чему эти соединения названы самыми важными биологически активными добавками десятилетия.

Экстракты получают из разных частей Винограда культурного. Так на основе семян за рубежом созданы лекарственные препараты и биологически активные добавки, известные под различными торговыми названиям и представленные на российском рынке - «Пикногенол», «Эндотелон», «Grape seed», «Французский парадокс» и др. Основное фармакологическое действие этих препаратов - лечение и профилактика сердечно-сосудистых заболеваний.

У нас в стране начало изучения биологически активных соединений винограда связано с изучением водно-спиртового экстракта гребней винограда под названием Каприм, разработанного около 30 лет назад в Тихоакеанском океанологическом институте АН СССР под руководством И.И. Брехмана.

Основное действие Каприма

токсическому действию алкоголя и сильные антиоксидантные свойства, на его основе до настоящего времени производится ряд БАД: «Корда-Парафарм», «Биомиллениум», «Нестарин» и др.

В качестве лекарственного растительного сырья для получения экстрактов винограда отечественные производители используют, как правило, гребни плодов винограда, однако в 2002 году появилась БАД «Иммортель», сырьём для получения которой, служат свежие плоды винограда. Помимо экстрактов винограда отечественные производители БАД начали выпускать «Экстракты красного виноградного вина» (Парафарм, Эвалар).

Отходом винодельческой промышленности помимо гребней является жом плодов винограда, который по содержанию полифенольных соединений превосходит гребни винограда и может стать перспективным сырьевым источником для получения обогащенных антиоксидантными веществами экстрактов.

Полифенольные соединения винограда представлены несколькими классами органических соединений, однако при стандартизации БАД на основе экстрактов винограда российские производители, как правило, не учитывают разнообразие структуры полифенольных соединений и присутствие взаимосвязи между биологической активностью и определяемой группой БАВ, что не соответствует требованиям, предъявляемым к современному фармакогностическому анализу.

Стандартизация экстрактов винограда представляет собой очень сложный и трудоёмкий процесс, требующий применения современных физико-химических методов анализа. Внедрение простых и легко воспроизводимых методик качественного и количественного анализа фармакологически значимых полифенольных соединений винограда является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является совершенствование методов стандартизации различных экстрактов винограда, а также лекарственных средств (ЛС) и биологически активных добавок (БАД), произведённых на их

основе, и изучение потенциальной возможности применения жома плодов винограда в качестве сырьевого источника для получения экстрактов с вйраженной биологической активностью.

В соответствии с указанной целью было предусмотрено решение следующих задач:

1. Подобрать оптимальные технологические условия для получения экстрактов из жома плодов винограда.

3. Изучить биологическую активность полученных экстрактов жома плодов винограда при помощи ферментных биотест-систем in vitro.

4. Провести скрининговый анализ полифенольных соединений винограда в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда с помощью химических и физико-химических методов анализа с целью выявления ведущей группы биологически активных веществ для каждого вида экстракта.

5. Обосновать основные показатели, характеризующие качественный состав и количественное содержание полифенольных соединений в сухих экстрактах гребней и жома плодов винограда.

6. Провести количественное определение полифенольных соединений в некоторых JIC и БАД на основе экстрактов винограда отечественного и зарубежного производства.

Впервые изучен полифенольный состав и биологическая активность высушенных водно-спиртовых экстрактов из жома плодов сортовой смеси Винограда культурного (Ркацители и Молдова), произрастающего на территории РФ. Показано, что изучаемые экстракты обладают выраженной антиоксидантной активностью, поэтому жом плодов винограда является перспективным сырьевым источником, альтернативой семян винограда.

Проведён скрининговый химический и физико-химический анализ полифенольных соединений в промышленных образцах сухого экстракта гребней винограда и в изучаемых образцах экстрактов из жома плодов винограда, по результатам которого выявлены ведущие группы биологически

активных веществ для последующей стандартизации этих экстрактов. Установлено наличие взаимосвязи между биологической активностью и содержанием отдельных групп полифенольных соединений.

На основании проведённых исследований обоснована необходимость комплексного подхода к стандартизации ЛС и БАД на основе различных экстрактов винограда, виноградного вина и сока по показателям качественный и количественный анализ БАВ.

Разработаны высокоспецифичные методики качественного анализа проантоцианидинов, позволяющие идентифицировать эти соединения в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛС и БАД, произведённых на их основе.

Разработаны методики количественного анализа проантоцианидинов и суммы полифенольных соединений в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛС и БАД, произведённых на их основе, обеспечивающие повышение требований к контролю качества данных добавок.

Положения, выносимые на защиту

На защиту выносятся результаты изучения полифенольного состава и биологической активности экстрактов из сортовой смеси жома плодов винограда (Ркацители и Молдова), а также промышленных образцов экстракта гребней винограда; результаты исследований по разработке комплексного подхода к качественному и количественному анализу биологически значимых полифенольных соединений винограда в различных экстрактах, ЛС и БАД.

Практическая значимость работы и внедрение в практику

Результаты исследований легли в основу разработки разделов «подлинность» и «количественное определение» биологически активных веществ нормативной документации (ТУ 9176-051-46865780-04) новой БАД «Экстракт красного вина - Парафарм».

На основе результатов проведённого исследования, при перерегистрации БАД «Корда-Парафарм» внесены изменения в разделы «подлинность» и

«количественное определение» биологически активных веществ нормативной документации (ТУ 9176-050-46865780-04), регламентирующей её качество.

Методики количественного анализа полифенольных соединений винограда апробированы в ОАО «Красногорсклексредства».

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на: XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2004 г.);11 научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды». Школа для специалистов: «Биокорректоры — нелекарственные оздоровительные продукты. Фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 25-26 мая 2004 г., МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет); Конгрессе детских кардиологов (г. Москва, 26 мая 2004 г.); Научно-практическом семинаре «Новые технологии биологической медицины (фундаментальные и клинические аспекты проблемы)» (г. Москва, 11 июня 2004 г., РАСХ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы ММА им. И.М. Сеченова «Разработка и совершенствование технологии подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием» (шифр 16, утвержденный МЗ РФ); в соответствии с комплексной темой кафедры общей химии стоматологического факультета ММА им. И.М. Сеченова: «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.200.118796).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложений. В работе 30 рисуноков, 30 таблиц. Список

цитируемой литературы включает в себя 152 источника, из них 82 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

В работе использовали следующие промышленные образцы растительного сырья: жом плодов винограда образец № 1 (сортовая смесь Ркацители и Молдова, урожай 2002 г, август), жом плодов винограда образец № 2 (сортовая смесь Ркацители и Молдова, урожай 2002 г, сентябрь). Промышленные образцы экстрактов, применяемые в производстве БАД «Корда-Парафарм»: сухой экстракт гребней винограда серия 011002, сухой экстракт гребней винограда серия 021002. А также экстракт красного виноградного вина - субстанция, применяемая для производства новой БАД «Экстракт красного вина - Парафарм».

В исследовании применяли JIC «Antistax» капе. № 50 (Pharmaton, Швеция) и БАД: «Нестарин» табл. № 20 (ООО «Здоровое отечество», г. Химки); «Корда-Парафарм» капе. № 10 (ЗАО «Парафарм» г. Москва); «Экстракт красного вина» капе. № 30 (ЗАО «Эвалар», г. Бийск); «Иммортель» 200 мл (ЗАО "Завод экологических технологий и экопитания ДИОД"); «Grape seed» капе. № 30 (Nature's Plus, США). .

Для проведения физико-химических исследований использовано следующее оборудование.

Высокоэффективный жидкостной хроматограф фирмы "Gilston" (Франция) с компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром» для "Windows" (версия 5). Насос для ВЭЖХ модель Pompa 305 "Zelson", позволяющий поддерживать расход элюента 0,110 мл/мин с возможностью работы при давлении до 400 бар.

Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ модели 151 UF-VIS "Gilston" с проточной кварцевой кюветой (длина оптического пути 10 мм), относительной погрешностью измерения не более ±5%, с программируемой сменой длин волн, позволяющей проводить измерения в диапазоне длин волн от 190 до 600 нм.

Инжектор ввода пробы типа «Реодайн 7125» с рабочим объёмом петли 5 - 10 мкл. Аналитическая хроматографическая колонка металлическая PLATINUM EPS С-18, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, с обращённофазовым сорбентом Nucleosil 100 С18 с зернением 5 мкм.

Саморегистрирующий спектрофотометр фирмы Gelios (США) с проточной кварцевой кюветой (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения не более ±5%, позволяющий проводить измерения в диапазоне длин волн от 190 до 900 нм.

Регистрирующий спектрофотометр Specord М 40 UV-VIS (Германия) с проточной кварцевой кюветой (10 мм), со спектральным диапазоном 185-900 нм. Источник излучения для УФ области спектра - дейтериевая лампа D2E; галогеновая лампа 6 В, 20 Вт для видимой области спектра. Приёмник: фотоумножитель. Уровень относительной погрешности измерения не более ±5%.

При проведении ТСХ-анализа были использованы хроматографические пластаны "KISELGEL 60 F 254" (Merck, Германия). Для идентификации полифенольных соединений в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда использовали систему растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода в соотношении 40:12:28 [Запромётов М.Н., 1974], а для качественного анализа проантоцианидинов: толуол - ацетон - муравьиная кислота в соотношении 6:6:1 частей по объёму [Lea A.G., 1979; Carando S., 1999].

В работе использовались реактивы, растворители, стандартные образцы, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Для выявления потенциальной адаптогенной, антиоксидантной, антимикробной и иммуномодулирующей активности исследуемых сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда применяли глутатионредуктазную, катал аз ную и НАДФН-оксидазную ферментные биотест-системы in vitro, разработанные в ВИЛАР и запатентованные в РФ (патенты № 2181890, № 218191, № 218192 приоритет от 06.06.2001).

Глутатионредуктаза и каталаза - коммерческие препараты высокой степени очистки. Источником НАДФН-оксидазы служили перитонеальные макрофаги крыс.

Статистическую обработку полученных в ходе исследования данных производили с использованием t-критерия Стьюдента.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В соответствии с задачами исследования методом перколяции 20, 40 и 60% этанолом нами были получены лабораторные образцы экстрактов жома плодов винограда. На стадии высушивания водно-спиртовых извлечений для максимального сохранения термолабильных полифенолов был использован метод лиофильной сушки при температуре 37°С на установке ТГ-15 (Германия). Качество экстрактов соответствовало требованиям ОФС «Экстракты» ГФ XI.

Полученные экстракты были протестированы на наличие биологической активности с помощью ферментных биотест-систем. В качестве контрольного образца был использован экстракт гребней винограда, являющийся действующей основой БАД Корда-Парафарм. Результаты изучения влияния сухих экстрактов жома плодов (ЭЖПВ) и гребней винограда (ЭГВ) на скорость глутатионредуктазной (ГР) и каталазной (КАТ) реакций in vitro представлены в таблице 1. Результаты тестов показали способность всех изучаемых экстрактов повышать скорости глутатионредуктазной и каталазной реакций, что свидетельствует о наличии у них антиоксидантной активности. Таким образом, было показано, что жом плодов винограда можно использовать в качестве потенциального сырьевого источника для получения экстрактов с антиоксидантной активностью.

Количественная оценка способности экстрактов жома плодов винограда повышать скорости указанных реакций, показала максимальную антиоксидантную активность для ЭЖПВ, полученного с помощью 60% этанола. Кроме того, для данного экстракта было показано наличие умеренной иммуномодулирующей активности. На основании результатов по

определению биологической активности была выбрана оптимальная концентрация экстрагента для получения экстрактов жома плодов винограда с максимальной антиоксидантной активностью. Эта концентрация этанола составила 60%.

В таблице 2 представлены результаты тестирования сухого экстракта жома плодов винограда, полученного экстракцией 60% этанолом, с помощью НАДФН-оксидазной биотест-системы in vitro, позволяющей выявлять вещества с иммуномодулирующими свойствами. Ранее было установлено, что иммуномодуляторы активируют НАДФН-оксидазу in vitro.

Из табл. 2 видно, что экстракт жома плодов винограда, полученный экстракцией 60% этанолом, при добавлении к гомогенатам «спокойных» макрофагов крыс немного, но достоверно активируют НАДФН-оксидазу. Активирующий эффект зависит от концентрации, для изучаемых сухих экстрактов винограда установлена прямая зависимость активирующего эффекта от концентрации.

Результаты скринингового химического и физико-химического анализа полифенольных соединений в анализируемых экстрактах винограда

С помощью общепринятых фармакопейных методик, применяемых для идентификации различных БАВ полифенольной структуры, в сухих экстрактах жома плодов винограда были обнаружены антоцианы и конденсированные дубильные вещества, в сухих экстрактах гребней винограда - флавоноиды и конденсированные дубильные вещества.

Результаты спектрофотометрического анализа в УФ-области показали, что спектры поглощения водно-спиртовых растворов сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда не идентичны: спектры поглощения растворов сухих экстрактов жома плодов винограда в 60% этаноле имеют максимум при длине волны 280 нм, а сухих экстрактов гребней винограда в 60% этаноле при длине волны 271,5 нм. Анализ полученных спектров позволяет сделать вывод о том, что в спектрах поглощения анализируемых экстрактов нет максимума поглощения в интервале длин волн 300-370 нм, характерного для спектров поглощения флавоноидов: рутина, кверцетина и др. Наличие максимумов поглощения в анализируемых экстрактах в интервале длин волн 270-290 нм характерно для катехинов, коричной и галловой кислот.

Влияние сухих экстрактов винограда на скорость глутатионредукташой (ГР) и каталазной (КАТ) реакций in vitro

Вариант опыта Скорость ГР мкмоль/мин на мг белка Относительное повышение скорости^%) Скорость КАТ мкмоль/мин на мг белка Относительное повышение скорости,(%)

Контроль (без добавок экстрактов) 9,22±0,10 100,011,08 19,1611,05 100,011,52

ЭЖПВ (20% спирт): 5 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 9,21 ±0,41 9,43±0,39 10,4910,27 99,914,45 100,214,14 113,812,57 22,0710,97 28,7410,74 30,9911,09 35,514,39 46,213,35 49,913,52

ЭЖПВ (40% спирт): 5 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 9,16±0,45 9,2610,33 10,0910,55 99,4±4,91 100,413,56 109,515,45 26,4910,53 30,4510,99 30,6311,03 42,612,00 49,013,25 49,313,36

ЭЖПВ (60% спирт): 5 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 9,2210,39 9,2410,48 10,8110,63 100,014,23 102,315,19 117,315,82 23,5810,99 29,0111,01 32,9710,88 37,0+4,20 46,713,48 53,012,67

ЭГВ: 5 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 9,4310,47 9,6010,43 10,57Ю,19 102,314,98 104,114,48 114,611,80 23,9610,96 24,6910,57 25,6810,89 34,612,18 35,711,28 37,1+1,95

Влияние экстрактов жома плодов винограда на скорость НАДФН-оксидазной реакции in vitro

Препарат, концентрация Скорость НАДФН-оксидазной реакции нмоль/мин х тыс. кл.

ЭЖПВ 3,3 мкг/мл 20,7±0,98

ЭЖПВ 6,6 мкг/мл 23,1±0,65

ЭЖПВ 9,9 мкг/мл 30,0± 1,09

Подбор условий хроматографического разделения методом ВЭЖХ включал в себя выбор сорбента, типа детектора и условий детектирования, оптимального состава подвижной фазы и скорости подачи элюента. Результаты исследования показали, что при использовании колонки Platinum EPS С-18 (4,6x250 мм) оптимальное разделение полифенольных соединений наблюдается в подвижной фазе состава: метанол-вода-фосфорная кислота конц. в соотношении 40:60:5. Со скоростью потока 0,5 мл/мин при использовании УФ-детектора при длине волны 254 нм.

Результаты качественного анализа полифенольных соединений, проведённого с помощью метода ВЭЖХ представлены в табл. 3 и 4, соответственно.

На основе проведенных исследований методом ВЭЖХ можно сделать следующие выводы: идентифицированные полифенольные соединения в сухих ЭЖПВ и ЭГВ представлены в основном галловой кислотой. В сухих экстрактах винограда методом внутренней нормализации определено, что галловая кислота составляет

от 60 до 70% от площади всех обнаруженных на хроматограмме пиков, т.е. составляет основную часть, перешедших в экстракты фенольных соединений.

Кофейная кислота в общем количестве выделенных веществ составляет от 0,34 % (экстракт гребней винограда) до 8,03 % в образце №2 экстракта жома плодов винограда.

Флавоноиды в образцах сухих экстрактов жома плодов винограда практически отсутствуют, лишь в образце № 2 зафиксирован апигенин в количестве 0,01%. В образце № 3 (сухой экстракт гребней винограда) флавоноиды представлены следующим образом: лютеолин-7-гликозид 23,23%; гиперозид 2,97%; рутин 1,23%; гесперидин 0,66% от суммы всех регистрируемых на хроматограмме органических соединений.

Количество неидентифицированных веществ колеблется от 10 до 13 и примерно одинаково во всех образцах. Анализ времени удерживания неидентифицированых соединений показал, что с достаточной степенью достоверности можно определить наличие трёх одинаковых веществ в образцах №1,2 (сухие экстракты жома плодов винограда) и одного вещества в образцах №1 и №3 (сухой экстракт гребней винограда). По составу остальных соединений не представляется возможным сделать достоверные выводы при отсутствии PCO.

Поскольку галловая кислота является доминантным соединением среди идентифицированных полифенольных соединений в анализируемых экстрактах, то представлялось целесообразным оценить её количественное содержание. Количественное определение галловой кислоты проводили методом абсолютной калибровки.

Результаты количественного определения галловой кислоты в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда представлены в таблицах 5 и 6.

Согласно результатам проведенных исследований в образцах сухих экстрактах винограда галловая кислота содержится в пределах 8 %. Её содержание практически одинаково во всех трёх экстрактах. Следовательно, возможна стандартизация сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда по показателю количественного содержания её в готовом препарате с использованием метода ВЭЖХ.

Дороговизна и трудоёмкость ВЭЖХ-анализа составляют главную сложность для использования этого метода в «рутинном» анализе, поэтому нами был осуществлён качественный анализ наиболее значимых соединений, идентифицированных методом ВЭЖХ, с помощью хроматографии в тонких слоях сорбента. Более низкая по сравнению с ВЭЖХ чувствительность данного метода позволила идентифицировать в экстрактах жома плодов винограда (образцы №1 и № 2) только галловую кислоту, а в экстракте гребней винограда галловую кислоту и лютеолин-7гликозид.

Результаты идентификации полифенольных веществ в сухих экстрактах жома плодов винограда (ЭЖПВ) и гребней винограда (ЭГВ) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

НАИМЕНОВАНИЕ PCO ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ PCO МИН КОМПОНЕНТЫ ИССЛЕДУЕМОГО ОБРАЗЦА ИДЕНТИФИЦИРОВАНО

ЭЖПВ образец №1 ЭЖПВ образец №2 ЭГВ образец №3 ЭЖПВ образец №1 ЭЖПВ образец №2 ЭГВ образец №3

Алигенин 92,58 - + + Апигенин Апигенин

Гиперозид 26,94 - - + Гиперозид

Геспередин 33,25 - - + Геспередин

Галловая кислота 6,202 + + + Галловая кислота Галловая кислота Галловая кислота

Кофейная кислота 9,205 + + + Кофейная кислота Кофейная кислота Кофейная кислота

Лютеолин-7-гликозид 23,73 - - + Лютеолин-7-гликозид

Рутин 28,13 - - + Рутин

Катехин 72,54 + + + Катехин Катехин Катехин

PCO 10 веществ 13 веществ 10 веществ не идентифицир овано не вденгифиц ировано не идентифици ровано

Результаты качественного анализа полифенольных веществ в сухих экстрактах винограда методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Образец № Сумма площадей всех пиков на хроматограмме, % Соотношение основных компонентов в образце, % Идентифицировано флавоноидов, % Идентифицировано других фенольнЫх соединений, %

ЭЖПВ образец №1 100 Галловая кислота 61,08 Кофейная кислота 4,76 Катехин 0,17 Неидентифицированное Вещество 33,79 Катехин 0,37 Галловая кислота 61,08 Кофейная кислота 4,76

ЭЖПВ образец №2 100 Галловая кислота 69,68 Кофейная кислота 8,03 Катехин 0,11 Неидентифицированное Вещество 19,98 Неидентифицированное Вещество 1,99 Апигенин 0,01 Катехин 0,11 Галловая кислота 69,58 Кофейная кислота 8,03

эгв образец №3 100 Галловая кислота 67,27 Кофейная кислота 0,34 Лютеолин-7-гликозид 23,23 Гиперозид 2,97 Рутин 1,23 Геснеридин 0,66 Катехин 0,22 Неидентифицированное Вещество 1,57 Неидентифицированное Вещество 1,58 Лютеолин-7-гликозид 23,23 Гиперозвд 2,97 Рутин 1,23 Гесперидин 0,66 Катехин 0,22 Галловая кислота 67,27 Кофейная кислота 0,34

Результаты количественного определения галловой кислоты в сухих экстрактах винограда методом ВЭЖХ.

ЭЖПВ (образец №1) ЭЖПВ (образец №2) ЭГВ (образец №3)

Масса, Найдено Масса, Найдено Масса, Найдено

г галловой Г галловой г галловой

кислоты, кислоты, кислоты,

0,1564 8,41 0,1167 8,41 0,0998 8,51

0,0782 8,69 0,1054 8,68 0,0876 8,77

0,0892 8,17 0,1203 8,16 0,1205 8,25

0,0785 8,63 0,1328 8,68 0,1024 8,75

0,1579 8,43 0,1171 8,22 0,1032 8,30

X 8,47 X 8,43 X 8,52

Метрологические характеристики результатов количественного определения галловой кислоты в сухих экстрактах винограда методом ВЭЖХ

Наименование п f Р% T(P,f) Х% S2 S Sx АХ Е%

ЭЖПВ (образец №1) 5 4 95 2,78 8,47 0,0423 0,2056 0,019 0,25 2,95

ЭЖПВ (образец №2) 5 4 95 2,78 8,43 0,0606 0,2460 0,1100 0,30 3,56

ЭГВ (образец №3) 5 4 95 2,78 8,52 0,0518 0,2433 0,1088 0,30 3,52

Стандартизация полифенольных соединений в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда

Для идентификации проантоцианидинов предложены варианты методик, основанные на реакции кислотного гидролиза соединений, сочетающегося с их окислением, а также на реакции взаимодействия проантоцианидинов с ванилиновым альдегидом. Последняя реакция позволяет также определять

катехины. Условия проведения реакции гидролитического разложения проантоцианидинов неодинаковы для сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда. Для последнего требуется более длительное нагревание -в течение 45 мин, в отличие от 5 мин, достаточных для появления специфичной малиновой окраски цианидина у раствора ЭЖПВ.

Качественный анализ индивидуальных проантоцианидинов был проведён методом ТСХ в системе растворителей: толуол - ацетон -муравьиная кислота в соотношении 6:6:1 частей по объёму, в качестве веществ сравнения использовали PCO (+)-катехин и ацетоновое извлечение из жома плодов винограда (сортовая смесь Ркацители и Молдова). В экстрактах жома плодов винограда обнаружены тримеры проантоцианидинов, связанные с галловой кислотой (ВГВ4) и один из низкомолекулярных проантоцианидинов ВГВ4 с Rf 0,48. В сухом экстракте гребней винограда идентифицированы два из низкомолекулярных проантоцианидинов Bi-B4 (Rf 0,48 и 0,50) и тримеры проантоцианидинов, связанные с галловой кислотой с Rf 0,36.

Помимо идентификации проантоцианидинов и катехинов в экстрактах гребней винограда определяли наличие суммы флавоноидов по реакции с алюминия хлоридом.

Для количественной оценки суммы проантоцианидинов применяли метод Porter L.J., суммарное количество полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту определяли по методу Folin-Ciocalteu. Результаты анализа представлены на рис 1.

Результаты количественного определения суммы проантоцианидинов и полифенолов в экстрактах жома плодов и гребней винограда

1- 20% сп. ЭЖПВ, образец 1,2- 20% сп. ЭЖПВ, образец И, 3 - 40% сп. ЭЖПВ, образец I; 4 - 40% сп. ЭЖПВ, образец II; 5- 60% сп. ЭЖПВ, образец I; 6 - 60% сп. ЭЖПВ, образец II; 7- ЭГВ серия 1; 8 - ЭГВ, серия 2.

Результаты количественного анализа проантоцианидинов в сухих экстрактах жома плодов винограда, полученных с помощью 20%, 40% и 60% этанола, позволяют сделать вывод о том, что содержание этих соединений составляет в среднем 24-30%. Относительная ошибка среднего результата для данной методики составила от 2,70 до 5,20%. При этом максимальное количество проантоцианидинов обнаружено в ЭЖПВ, полученном экстракцией 60% этанолом.

Результаты количественного анализа проантоцианидинов методом кислотного гидролиза в среде бутанола показали низкое содержание этих соединений в сухом экстракте гребней винограда (не более 1,5%). Содержание суммы полифенольных соединений в различных экстрактах жома плодов винограда в отличие от экстрактов гребней винограда существенно ниже, чем содержание в них суммы проантоцианидинов. Это объясняется тем, что метод РоПп-Сюсакеи позволяет определять полифенольные соединения, находящиеся в свободном виде, а кислотный гидролиз с последующим

определением антоцианов по методу Porter позволяет определять антиоксиданты в связанном, т.е. в форме проантоцианидинов, виде.

Низкое содержание проантоцианидинов в экстракте гребней винограда свидетельствует об отсутствии олигомерных и полимерных форм этих соединений в данном экстракте, следовательно, антиоксиданты ЭГВ представлены, преимущественно, свободными полифенолами.

Результаты определения суммы проантоцианидинов и суммы свободных полифенольных соединений свидетельствуют о том, что максимальное количество и тех и других соединений содержится в экстракте жома плодов винограда, полученном с помощью 60% этанола, что и объясняет его более высокую биологическую активность по сравнению с ЭЖПВ, полученными экстракцией 20% и 40% этанолом.

При ориентировочном фитохимическом анализе в сухом экстракте гребней винограда (с помощью реакции с алюминия хлоридом) были идентифицированы флавоноиды, поэтому было решено провести количественный анализ флавоноидов в сухом экстракте гребней винограда.

Количественный анализ флавоноидов в сухих экстрактах гребней винограда показал, что их содержание превышает содержание проантоцианидинов и составляет 2,59±0,08% и 2,44+0,09%, соответственно, для двух серий экстрактов. Относительная ошибка среднего результата составила для данной методики от 3,09 до 3,46%.

Таким образом, в ЭГВ количественное содержание флавоноидов превышает содержание проантоцианидинов приблизительно в 2 раза, что позволяет сделать вывод о преобладании флавоноидов, следовательно, стандартизовать ЭГВ необходимо по сумме флавоноидов, а не проантоцианидинов. Данные выводы согласуются с фармакологической активностью ЭГВ, обладающего выраженными антиоксидантными, адаптогенными и дезинтоксикационными свойствами, при этом влияние ЭГВ на сердечно-сосудистую систему, реализующееся, прежде всего, за счёт проантоцианидинов, не выражено.

Количественный анализ полифенольных соединений в некоторых ЛП и Б АД иа основе экстрактах винограда

Результаты количественного определения суммы проантоцианидинов в пересчёте на цианидин и суммы полифенолов, в пересчёте на галловую кислоту в ЛП и шести БАД представлено на рис. 2.

Результаты количественного определения суммы проантоцианидинов и полифенолов в изучаемых ЛС и БАД

□ суммы проантоцианидинов ■ сумма полифенолов

Результаты определения суммы проантоцианидинов по методу Porter показывают, что их содержание в анализируемых добавках колеблется в широких пределах. Максимальное количество проантоцианидинов обнаружено в БАД «Grape seed», оно составляет 57,87±1,82%. Далее следует БАД «Иммортель», действующей основой которой является концентрированный сок из плодов красного винограда, содержание проантоцианидинов в ней составляет 16,70±0,35%. БАД на основе экстрактов красного виноградного вина содержат умеренное количество проантоцианидинов, которое для «Экстракта красного вина» (Эвалар) составляет 7,41 ±0,26%, а для «Экстракта красного вина-Парафарм» -8,45±0,24%.

Биологически активные добавки на основе экстрактов из гребней и листьев винограда по результатам проведённого анализа содержат небольшое количество проантоцианидинов, которое для двух БАД - «Корда-Парафарм», «Нестарин» и ЛП «Antistax» в среднем не превышает 1,5%. Относительная ошибка среднего результата для использованной методики составила от 2,10 до 5,52%.

Результаты количественного анализа проантоцианидинов в различных БАД схожи с результатами анализа этих соединений в сухих экстрактах гребней винограда, согласно которым проантоцианидины не являются ведущей группой биологически активных веществ для данных экстрактов. Кроме того, было показано, что препарат «Antistax», содержащий в качестве действующей основы экстракт листьев винограда, также характеризуется низким содержанием проантоцианидинов, поэтому для ЛС и БАД на основе экстрактов из гребней и листьев винограда был проведён количественный анализ суммы флавоноидов.

Результаты количественного определения флавоноидов в БАД «Корда-Парафарм», «Нестарин» и ЛП «Antistax» показали, что содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин составляет для первой добавки 2,28±0,07%; для второй - 1,94±0,06%, а для третьей - 3,7810,07%, что во всех случаях превышает содержание суммы проантоцианидинов.

Анализ показаний к применению ЛС и БАД на основе экстрактов из гребней и листьев винограда свидетельствует о том, что их основными фармакологическими эффектами являются укрепление сосудистых стенок вен и капилляров (Р-витаминная активность), адаптогенное, общеукрепляющее и антиоксидантное действие, что связано, прежде всего, с присутствием в них флавоноидов. Таким образом, результаты проведённого анализа и данные по биологической активности показывают необходимость стандартизации биологически активных добавок на основе экстрактов из гребней и листьев винограда по показателю количественное содержание суммы флавоноидов, а не проантоцианидинов.

В отличие от препаратов на основе экстрактов листьев и гребней винограда, препараты, содержащие экстракты семян, жома плодов винограда, красного виноградного вина или сока содержат большое количество проантоцианидинов и назначаются, главным образом, для профилактики и комплексного лечения сердечно-сосудистых заболеваний, поэтому их необходимо стандартизовать по показателю количественное содержание проантоцианидинов по методу Porter, который позволяет определять проантоцианидины в форме олигомеров и полимеров.

Результаты по определению суммы полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту по методу Folin-Ciocalteu (FC) показывают, что содержание суммы полифенолов в изучаемых БАД колеблется значительно меньше, чем содержание проантоцианидинов. Максимальное количество анализируемых соединений, так же как и проантоцианидинов, содержится в БАД «Grape seed». Для данной добавки оно составляет 25,58+1,14%.

Аналогично результатам анализа экстрактов из жома плодов винограда, содержание суммы проантоцианидинов, определённое по методу Porter, для БАД «Grape seed» превышает содержание суммы полифенольных соединений, определённое по методу FC. Это объясняется специфичностью метода Porter, который позволяет определять сумму проантоцианидинов опосредованно через количество выделившегося цианидина в процессе гидролиза олиго- и полимерных форм соединений, в отличие от анализа суммы полифенолов по методу Folin-Ciocalteu, который, как отмечалось ранее, позволяет определять полифенольные соединения, находящиеся в свободном состоянии. Следовательно, в экстрактах на основе семян и гребней винограда содержатся преимущественно олигомерные и полимерные формы проантоцианидинов.

Для БАД «Иммортель» содержание суммы полифенольных соединений составляет 22,85+0,57% и превышает содержание суммы проантоцианидинов. Высокое значение этого показателя связано с тем, что в состав препарата

введена аскорбиновая кислота, являющаяся активным восстановителем с полифенольной структурой.

Для остальных изучаемых Б АД содержание суммы полифенольных соединений составляет от 9,00 до 12,69% и превышает содержание проантоцианидинов, что свидетельствует о том, что проантоцианидины представлены в данных БАД низкомолекулярными фракциями, менее активными с фармакологической точки зрения по сравнению с олигомерными и полимерными фракциями. Относительная ошибка среднего результата для метода Фолина-Чикальтео составила от 2,49 до 5,80%.

1. Подобраны оптимальные технологические условия получения экстрактов жома плодов винограда; с помощью ферментных биотест-систем in vitro показано наличие максимальной антиоксидантной активности у экстракта, полученного с помощью 60% этанола.

2. Проведён скрининговый анализ полифенольных соединений в экстрактах жома плодов винограда и экстракте гребней винограда с помощью специфических химических реакций, ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.

3. Подобраны оптимальные условия для ВЭЖХ-анализа, что позволило идентифицировать в экстракте гребней винограда галловую кислоту, кофейную кислоту, флавоноиды (апигенин, катехин, кверцетин, рутин, гесперидин); в экстрактах жома плодов винограда галловую кислоту, кофейную кислоту и катехин. Установлено, что галловая кислота является доминантным соединением для всех изучаемых экстрактов.

4. Предложены и обоснованы методики качественного и количественного анализа полифенольных соединений в анализируемых экстрактах жома плодов и гребней винограда, доступные для реализации в производственных условиях.

5. Проведён количественный анализ суммы флавоноидов, проантоцианидинов и свободных полифенолов в JIC и БАД,

производимых на основе экстрактов из различных частей Винограда культурного.

1 6. Выявлены ведущие группы БАВ для различных экстрактов винограда, что позволило разработать комплексный подход, согласно которому стандартизацию экстрактов жома плодов, семян винограда, сухих экстрактов вина, экстрактов из свежих виноградных плодов и, соответственно, ЛС и БАД на их основе необходимо проводить по двум показателям: содержание суммы проантоцианидинов, в пересчёте на цианидин и содержание суммы полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту', экстракты гребней и листьев винограда, а также ЛС и БАД на их основе по показателям' содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин и содержание суммы полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту.

7. Полученные данные могут быть использованы для стандартизации и повышения контроля качества ЛС и БАД, содержащие экстракты винограда. На основании результатов проведённого исследования внесены изменения в соответствующие разделы нормативной документации, регламентирующей качество БАД «Корда-Парафарм» и «Экстракт красного вина - Парафарм».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ерёмина A.B., Попков В.А., Дегтярёва Е.А., Решетняк В.Ю. Биологически активные вещества винограда: классификация, фармакологические эффекты, лекарственные препараты и БАД на их основе // Натуротералия и гомеопатия. - 2003. - № 4. - С. 27-30.

2. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Везиришвили М.О. Определение полифенольного состава сухого экстракта гребней винограда методом ВЭЖХ // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - Т. 38, № 3. - С. 2628.

3. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Везиришвили М.О. Комплексный подход к стандартизации экстракта красного вина // Труды международного биотехнологического центра МГУ им. М.В. Ломоносова «Биотехнология -охране окружающей среды». - М: Спорт и культура. - 2004. - С. 202-207.

4. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Везиришвили М.О. Новый подход к стандартизации комплекса полифенолов гребней винограда (Kill В) // Труды международного биотехнологического центра МГУ им. М.В. Ломоносова «Биотехнология - охране окружающей среды». - М: Спорт и культура. - 2004. - С. 206.

5. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Везиришвили М.О. Количественный анализ проантоцианидинов в сухом экстракте вина // Труды международного биотехнологического центра МГУ им. М.В. Ломоносова «Биотехнология -охране окружающей среды». - М: Спорт и культура. - 2004. - С. 207.

6. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Поткин A.B., Жданова О.И. Перспективы применения фитокомплекса Иммортель в детской кардиологии // Тезисы Всероссийского Конгресса «Детская Кардиология 2004». - Москва, 2004. -С.351-352.

7. Ерёмина A.B., Везиришвили М.О., Решетняк В.Ю. Стандартизация полифенольных соединений сухого экстракта гребней винограда // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М: Медицина. -2004.-С. 785.

к диссертационной работе Ерёминой Анастасии Викторовны на тему: «Фитохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки Винограда культурного (Vitis vimfera L.)»

В ходе исследования был впервые изучен полифенольный состав и

биологическая активность высушенных водно-спиртовых экстрактов из жома плодов сортовой смеси Винограда культурного (Ркацители и Молдова), произрастающего на территории РФ. Показано, что изучаемые экстракты обладают выраженной антиоксидантной активностью, поэтому жом плодов винограда является перспективным сырьевым источником.

Проведён скрининговый химический и физико-химический анализ полифенольных соединений в различных экстрактах винограда, по результатам которого выявлены ведущие группы биологически активных веществ для последующей стандартизации этих экстрактов.

На основании проведённых исследований разработан комплексный подход к стандартизации различных экстрактов винограда и виноградного вина. Предложены высокоспецифичные методики качественного и количественного анализа проантоцианидинов и других полифенольных соединений в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛП и Б АД, произведённых на их основе, обеспечивающие повышение требований к их контролю качества.

"Phytochemical study and standardization of some drugs and food additives based on different extracts from grape (Vitis vinifera L.)"

In the process of experiments polypbenolic composition and biological activity of

grape by-products extracts (kinds "Молдова", "Ркацители" (Russia) have been studied for the first time. It has been shown that these extracts have very strong antioxidant activity and can be perspective source of biological active substances

Chemical and physiochemical analysis of polypbenolic substances were conducted in various grape extracts thereby main groups of biological active substances were detected for later standardization these extracts.

Comprehensive method standardization of various grape and wine extracts have been developed. Specific techniques of qualitative and quantitative analysis of proanthocyanidins and another polyphenols substances of various grape extracts were developed for improve die quality of some drugs and food additives consist of it

РНБ Русский фонд

Заказ № 743 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавской пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www autoreferat ru

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎