автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.11, диссертация на тему: Определение состава и качества меда методом ВЭЖХ
Защита состоится 22 сентября 2009 г. В 15-30 на заседании диссертационного совета Д 002.259.04, при Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН, г. Москва, Ленинский проспект, д. 31, кор. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН.
Автореферат размещен на сайте института ИФХЭ РАН http://phyche.ac.ru
Автореферат разослан « 2Р » _2009 г.
Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим высылать по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский проспект, д. 31, кор. 4, ИФХЭ РАН, ученому секретарю диссертационного совета Д 002.259.04 Ученый секретарь .
диссертационного совета, /¿о
кандидат химических наук Коломиец Л.Н.
Общая характеристика работы
Значение меда трудно переоценить ввиду того, что входящие в его состав вещества имеют огромное значение в пищевой промышленности и медицине. Мед является естественным природным продуктом и используется человечеством на протяжении всей его истории. Но пристальное внимание науки к его составу и свойствам появилось относительно недавно.
В настоящее время известно, что основную часть пчелиного меда составляют углеводы (глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и др.). Их общее содержание достигает 80%. Глюкоза и фруктоза составляют 80-90% от суммы всех сахаридов в созревшем меде, сахароза - до 5%. Вода составляет порядка 18%, в зависимости от типа и зрелости меда. Оставшиеся 2-3% составляют микроэлементы и различные полифенольные соединения, обеспечивающие лечебные и антиоксидантные свойства меда.
Состав меда строго регламентируется нормами ГОСТ. Однако эти нормы опираются на устаревшие методы анализа, зачастую не способные дать достоверные результаты. Так, описанный в ГОСТе метод определения углеводного состава меда основан на определении оптической плотности раствора феррицианида калия после того, как он прореагирует с редуцирующими сахарами меда. Метод испытания включает определение Сахаров меда до и после инверсии. Данный метод анализа является косвенным и не позволяет определить количественное содержание каждого из моносахаридов. Также он не позволяет однозначно определить содержание сахарозы, поскольку в меде
может содержаться мальтоза и другие ди- и олигосахариды.. Например, пр искусственном добавлении пищевого сахара в прикорм пчел в меде увелич! вается содержание олигосахаридов, что может нанести вред при употребл( нии такого меда в пищу людьми, страдающими сахарным диабетом. Ста! дартный метод дает общую картину наличия олигосахаридов, но не позвол) ет определить содержание каждого из них.
Аналогичная ситуация наблюдается и при определении остальны компонентов меда. Так, метод определения 5 - гидроксиметилфурфурап (5-ГМФ) основан на его спектрофотометрическом анализе в присутстви барбитуровой кислоты и пара-толуидина (метод Винклера). Этот метод так» является косвенным, сильно зависит от качества используемых реактивов не обладает высокой достоверностью.
Учитывая текущую ситуацию в области методик определения состава качества меда, актуальным является разработка современных, просты: безопасных и высокоэффективных методов пробоподготовки и анализа. На1 большей перспективностью в данном направлении обладают методы высою эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Они позволяют селе] тивно и высокоточно определять содержание всех основных компоненте меда, а также нежелательных веществ, таких как антибиотики. В настоящ« время в России широко используются методы ВЭЖХ для анализа меда. Те не менее, в ГОСТе нет ни одной ВЭЖХ методики для определения состава качества меда.
Существующие в данный момент ВЭЖХ методики нельзя признать достоверными в силу отсутствия государственной аттестации. Такие методики не могут использоваться контролирующими организациями.
Цель работы: Разработка хроматографических методов определения качества меда с целью их включения в систему ГОСТ.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
• Разработка, валидация и аттестация методики определения углеводного состава меда методом ВЭЖХ.
• Разработка, валидация и аттестация методики определения содержания 5-ГМФ в меде методом ВЭЖХ.
• Разработка, валидация и аттестация методики определения остатков антибиотиков в меде методом ВЭЖХ.
Впервые была проведена работа по подготовке методики для внесения ее в ГОСТ, включая такие этапы как:
• Подбор условий хроматографирования
• Выбор колонки и сорбента
• Подбор элюента и его состава
• Выбор режима хроматографирования (скорость потока элюента, температура колонки)
• Сбор и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001
Также был проведен сравнительный анализ содержания 5-ГМФ в ос новных промышленных сортах меда. Обнаружена зависимость начальной уровня содержания 5-ГМФ от сорта меда.
Включение этапа валидации позволяет определить достоверность ме тода анализа, что необходимо для внесения методики в ГОСТ.
Разработанные методики при условии внесения их в ГОСТ могут при меняться в различных производственных лабораториях и лабораториях кон тролирующих организаций.
На защиту выносятся следующие положения:
■ Результаты разработки методики определения углеводного состав меда и ее валидации.
■ Результаты разработки методики определения содержания 5-ГМ< в меде и ее валидации.
■ Результаты разработки методики определения хлорамфеникол (Chloramphenicol, САР) в меде и ее валидации.
По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, и 4 тезиса докладов на международных конференциях.
Результаты были представлены в виде докладов на 10-й международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва, 2006) и в виде статей в журнале «Сорбционные и хроматографические процессы». 2007. Т.7. Вып.5.
Структура и объем работы:
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы из 260 наименований и содержит 18 таблиц и 46 рисунков.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель работы и положения, выносимые на защиту.
Первая глава представляет собой литературный обзор современной методологии определения состава и качества пищевых продуктов. Основное внимание уделено рассмотрению общепринятых методов анализа, используемых при определении качества и состава пищевых продуктов, их возможностям и ограничениям. Рассмотрены ключевые источники существующих ограничений, предложены альтернативные варианты.
В этой же главе рассматривается состояние одного из перспективных вариантов анализа, развивающегося сегодня - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с различными вариантами детекти-
рования. Показана его роль, применительно к объекту исследования - пчелиному меду, рассматриваются основные достоинства и недостатки.
Во второй главе описывается оборудование и методика эксперимента. Исходные вещества. Оборудование. Методика эксперимента
Для выполнения данной работы использовали следующее оборудование и реагенты:
1. Анализ проводился на жидкостном хроматографе "Agilent 1100" (Agilent, США), в состав которого входили:
дегазатор, насос, автосамплер, термостат колонок, детекторы: рефрактометрический и спектрофотометрический на диодной матрице Для определения углеводного состава меда использовалась колонка "Supelco" с сорбентом Supelcosil LC-NH2 (Supelco, Чехия) длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц 5 микрон Для определения содержания 5-ГМФ и САР использовалась колонка "Zorbax" с сорбентом Eclipse XDB С-18 (Agilent, США) длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц 5 микрон
Для записи и обработки полученных результатов использовалось программное обеспечение - ChemStation Rev. В.01.03
2. Для приготовления стандартных и рабочих растворов нужной концентрации использовались:
- микропипетки "VWR" объемом 100 и 1000 мкл (VWR, США)
- пипетка "Biohit" объемом 5 мл (Biohit, Франция)
- Колбы мерные наливные объемом 25 мл класса точности 2
- Ультразвуковая ванна "Elma" Elmasonic S 30 Н (Elma, Германия)
- Ацетонитрил для ВЭЖХ "Lecbiopharm" 200 (Россия)
3. Для взвешивания образцов применялись весы аналитические "AnD GR-202" (точность 0,00001 г) (AnD, Япония)
4. Для подготовки воды применялась установка водоподготовки "Millipore Simplicity"
5. Фильтры мембранные диаметром 13 мм и размером пор 0.45 микрон использовались для фильтрации приготовленных растворов.
В качестве подвижной фазы использовалась смесь ацетонитрилУвода в различных объемных соотношениях.
Определение углеводного состава меда
Раствор стандартов готовили по точной навеске. Для обеспечения длительного хранения стандартный раствор смешивали с ацетонитрилом Lecbiopharm в объемном соотношении 1/1. Рабочие растворы стандартов готовили разбавлением стандартного раствора смесью вода-ацетонитрил с объемным соотношением 1/1.
При анализе образцов меда растворы готовили следующим образом: 1г исследуемого меда (точная навеска) растворяли в 50 мл воды для ВЭЖХ.
Раствор перемешивали до полного растворения меда в УЗ - ванне при ком натной температуре в режиме «перемешивание». Затем раствор фильтрова ли через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Фильтрат сме шивали с ацетонитрилом в объемном соотношении 1/1 и анализировали ме тодом ВЭЖХ.
В процессе отработки методики были определены условия анализа: - режим элюирования изократический, состав подвижной фазы ацетонит рил/вода в объемном соотношении 82/18 без смешения из двух отдельны; емкостей. Таким образом была устранена флуктуация базовой линии. Со став подвижной фазы может варьироваться для достижения полного разде ления пиков глюкозы и фруктозы.
Определение содержания 5-ГМФ.
При разработке методики стандартный раствор готовили по точной навеске. Рабочие растворы - путем разбавления стандартного раствора непосредственно перед анализом.
При анализе образцов меда растворы готовили следующим образом: 1г исследуемого меда (точная навеска) растворяли в 50 мл воды для ВЭЖХ. Раствор перемешивали до полного растворения меда в УЗ - ванне при комнатной температуре в режиме «перемешивание». Затем раствор фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. Фильтрат анализировали методом ВЭЖХ.
В процессе отработки методики были определены условия анализа:
- рабочая длина волны 5-ГМФ была определена по УФ-спектру и составила 284 нм;
- для повышения эффективности разделения применялся градиентный режим элюирования:
0-7 мин. - вода : ацетонитрил (97 : 3 об.); 7-12 мин. - вода : ацетонитрил (0 : 100 об.); 12-17 мин. - вода : ацетонитрил (97 : 3 об.);
- объемная скорость элюирования составляла 1,0 мл/мин.;
- объем инжекции 20 мкл;
- температура термостата колонки 30°С;
Состав фазы может варьироваться для достижения оптимального разделения.
Определение содержания САР.
Для повышения чувствительности метода и избавления от мешающих анализу компонентов меда было необходимо провести пробоподготовку. Вариант 1. Жидкостная экстракция.
Навеску меда 10 г помещали в полипропиленовую тубу для центрифугирования и растворяли в 10 мл воды для ВЭЖХ в УЗ-ванне в течение 10 минут в режиме «sweep». К полученному раствору приливали 20 мл EtAc. Смесь встряхивали 5 минут на механической мешалке типа Vortex. Затем тубу помещали в центрифугу на 30 мин при 10000 об/мин. Органическую фазу
отбирали медицинским шприцем, переносили в грушевидную колбу и упари вали досуха в роторном испарителе при 50°С. Полученный осадок перерас творяли в 1 мл метанола. Раствор фильтровали через мембранный фильтр диаметром пор 0,45 микрон.
Замечание: Осадок имел интенсивную окраску и запах.
Анализ полученного раствора проводили в изократическом режиме ] режиме градиентного элюирования.
Варианты хроматографирования раствора меда.
Условия хроматографирования экстракта меда Время анализа Время удерживания стандарта
Фаза 30/70 АСЫ/5% уксусная 15 мин 4,24 мин
Фаза 20/80 АС№5% уксусная 15 мин 10,84
Градиент 1: 0-5 мин 30 5,5-10 мин 100% ACN 10,5-15 мин 30% АСЫ 15 мин 4,20
рабочая длина волны - 278 нм. Температура колонки 40°С. Скорость 1 мл/мин
Жидкостная экстракция позволяет извлечь САР из раствора меда и увеличить чувствительность метода. В тоже время наряду с САР из раствор меда экстрагируются вещества полифенольного ряда, что существенно затрудняет идентификацию САР.
В качестве альтернативного варианта пробоподготовки был выбран вариант с твердофазной экстракцией на патронах Isolute. Этот вариант рекомендован производителем оборудования для ВЭЖХ - компанией Agilent.
Вариант 2. Экстракция на патроне Isolute.
Навеску меда 5 г растворяли в 20 мл воды. Раствор загружали в патрон. Выдерживали 5 мин. Затем удаляли воду под вакуумом. После удаления воды через патрон пропускали 50 мл EtAc. Операция проводилась при атмосферном давлении. Органическую фазу собирали и упаривали в грушевидной колбе в роторном испарителе. Полученный осадок перерастворяли в 1 мл смеси вода/метанол в соотношении 9/1. Раствор фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 микрон.
Замечания: Собирать остатки органической фазы необходимо с особой осторожностью. Водная фаза при вакуумировании удаляется не полностью и при резком усилении вакуума выходит вместе с органической фазой. По этой причине было решено отказаться от данного варианта экстракции.
Вариант 3. Комбинация твердофазной и жидкостной экстракции.
Для максимально эффективной экстракции САР и удаления полифе-нольной части было решено совместить предыдущие варианты экстракции.
Навеску меда Зг помещали в полипропиленовую тубу для центрифугирования. Растворяли в 10 мл воды для ВЭЖХ. К раствору добавляли 20 мл этилацетата. Встряхивали на механической мешалке типа Vortex. Тубу помещали в центрифугу на 10 минут при 10000 об/мин. Органическую фазу от-
бирали и упаривали досуха на роторном испарителе при комнатной темпера туре в грушевидной колбе. Полученный осадок перерастворяли в 30 мл воды Данная процедура позволяет освободиться от полифенольной части меда, ко торая в воде практически не растворяется. Раствор переносили в тубу дл) центрифугирования. Грушевидную колбу ополаскивали 5 мл гексана. Смьн добавляли в тубу с водным раствором. Энергично встряхивали тубу и поме щали ее в центрифугу на 10 мин при 10000 об/мин. Органический слой уда ляли. Водную фазу пропускали через картридж для твердофазной экстракцш Varían Bond Elute С18 со скоростью 2 капли в секунду. Жидкость удаляли картридж промывали 1 мл воды, затем еще 2 мл воды. Смыв также удаляли. Картридж просушивали под вакуумом. В чистую пробирку с картриджа де лали смыв 4 мл МеОН. Растворитель упаривали досуха под струей чистого воздуха. Осадок перерастворяли в 1 мл 3% уксусной кислоты. Анализ проводили по следующим схемам:
Градиент 2: 0-10 мин 25% ACN, 10,5-15 мин 100% ACN, 15,5-20 мин 25% ACN, 5 мин промывка после анализа. Время удерживания 4,94.
Градиент 3: 0-10 мин 2% ACN, 10,5-12 мин 25% ACN, 12-20 мин 25% ACN, 20,5-21 мин 90% ACN, 21-25 мин 90% ACN , 25,5-30 мин 2% ACN, 5 мин промывка после анализа. Время удерживания 17,1.
Градиент 4: 0-10 мин 2% АСЫ, 10,5-18 мин 25% АСЫ, 18-26 мин 25% АСЫ, 26,5-27 мин 90% АСЫ, 27,5-32 мин 90% АСЫ, 32,5-37 мин 2% АС1Ч, 5 мин промывка после анализа. Время удерживания 21,2.
В третьей главе представлены результаты проведенных исследований, а также результаты валидаций разработанных методик.
Углеводный состав меда
На основе разработанной методики были проведены анализы четырех видов меда: подсолнечниковый, липовый, гречишный и цветочный. Хрома-тограммы исследованных медов представлены на рисунках 1.1. - 1.4.
Рис 1.1. Хроматограмма подсолнечникового меда
Рис 1.2. Хроматограмма гречишного меда
Рис 1.3. Хроматограмма липового меда
в В 10 12 14 пш
Рис 1.4. Хроматограмма цветочного меда
Для оценки воспроизводимости результатов были проведены 5 параллельных опытов с растворами одного и того же меда. Были приготовлены 5 одинаковых растворов одного меда. Относительное стандартное отклонение площадей пиков 5 инжекций из разных виал составило для фруктозы и глюкозы 0,27 и 0,50% соответственно. Сахароза и мальтоза в представленном образце отсутствовали.
Для оценки извлекаемое™ углеводов из меда были проведены опыты с добавками по методу «введено/найдено»: к образцам различных медов с известным содержанием углеводов (содержание углеводов определялось по калибровочному графику) добавили по 0,02, 0,04 и 0,06 г (точная навеска) фруктозы и глюкозы на грамм анализируемого меда. Для каждой добавки готовили по 3 навески исследуемого меда.
Результаты опытов с добавками к различным типам меда
Добавка Отклонение Подсолнечник Гречишный Цветочный Липовый
Фруктоза Глюкоза Фруктоза Глюкоза Фруктоза Глюкоза Фруктоза Глюкоза
0,02 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.02 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Srixj Относительное среднеквадр. отклонение 0.37 0.43 0.13 0.29 0.19 0.35 0.11 0.24
0,04 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Sr(х) Относительное среднеквадр. отклонение 0.04 0.01 0.21 0.19 0.15 0.33 0.17 0.35
0,06 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.01 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Srix) Относительное среднеквадр. отклонение 0.07 0.51 0.29 0.27 0.14 0.20 0.07 0.26
На основе разработанной методики были проведены анализы четырех видов меда: подсолнечникового, липового, гречишного и каштанового. Хро-матограммы исследованных медов представлены на рис. 2.1. - 2.4.
Рис 2.2. Хроматограмма гречишного меда
Для оценки воспроизводимости результатов были проведены 3 параллельных опыта с растворами одного и того же меда. Относительное стандартное отклонение площадей пиков 3-х инжекций из разных виал составило 0,36 %.
Для оценки извлекаемости 5-ГМФ из меда были проведены опыты с добавками по методу «введено/найдено»: к образцам различных медов с известным содержанием ГМФ (определено по калибровочному графику) были добавлены 1/10, 1/4, 1/2, 1 и 3/2 ПДК. Для каждой добавки готовили по 3 навески исследуемого меда, в каждую из которых вносили добавку непосредственно перед анализом, что обусловлено лабильностью 5-ГМФ в водных растворах меда.
Результаты опытов с добавками к различным типам меда
Добавка Отклонение Каштановый Гречишный Подсолнечник Липовый
2,5 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.19 0.28 0.06 0.10
Srix) Относительное среднеквадр. отклонение 9.54 10.61 2.48 4.31
6,25 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.42 0.43 0.07 0.10
Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 6.97 6.97 1.20 1.69
12,5 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.15 0.68 0.18 0.08
Sr( х) Относительное среднеквадр. отклонение 1.19 5.87 1.55 0.67
25,0 S(x) Среднеквадр. отклонение 0.17 0.87 0.28 0.40
37,25 S(x) Среднеквадр. отклонение 1.43 0.86 0.31 0.83
Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 3.92 2.34 0.89 2.23
Определение САР в меде.
На основе разработанной методики был проведен анализ купажного
Рис 3. Хроматограмма экстракта купажного меда с добавкой САР. Градиент 4.
Для оценки извлекаемости САР из меда были проведены опыты с добавками по методу «введено/найдено»: К образцам меда с известным содержанием САР (определено по калибровочному графику) добавляли раствор САР до достижения концентраций 0,1; 0,5 и 1,0 нг/мл. Для каждой добавки готовили по 3 навески исследуемого меда.
Результаты опытов с добавками САР к купажному меду
Добавка Отклонение Значение
0,1 S(x) Среднеквадр. отклонение 0,18
Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 0,86
0,5 S(x) Среднеквадр. отклонение 0,28
Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 1,32
1,0 S(x) Среднеквадр. отклонение 0,18
Sr(x) Относительное среднеквадр. отклонение 0.85
1. Изучено состояние современной методологии определения каче ственного и количественного состава меда. Критически рассмот рены достоинства и недостатки существующих методов и пока заны ограниченные возможности последних при решении задач определения качественного и количественного состава меда. В результате сформулирована цель исследования.
2. Разработана отвечающая современным требованиям методика определения углеводного состава меда. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Точность определения составляет 98%. Методика прошла этап валидации.
3. Создана методика определения содержания 5-ГМФ в меде методом ВЭЖХ. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Точность определения составляет 97%. Методика позволяет контролировать стадии хранения и переработки меда. Методика прошла стадию валидации.
4. Разработана схема пробоподготовки образцов меда для последующего определения методом ВЭЖХ, включающая жидкостную и твердофазную экстракции.
5. Предложена методика хроматографического определения содержания САР в меде на уровне 0,1-1,0 нг/мл. Проведен статистический отбор данных и обработка результатов согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2001. Метод прошел стадию внутрилабораторной стандартизации. Точность определения составляет 95%.
6. Реализация результатов работы, а именно включение методик в ГОСТ, даст возможность применять их в различных производственных лабораториях и лабораториях контролирующих организаций. Это позволит повысить точность и достоверность проводимых анализов меда, а также станет эффективным инструментом при выявлении фальсификатов меда.
1. Определение 5-гидроксиметилфурфураля в меде методом ВЭЖХ Романов A.B., Ларионов О.Г., Балашова Е.Ю., Коржов П.Б., Дуби чев А.Г.// Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. Вып.5. С.711-718
2. Определение углеводного состава меда методом ВЭЖХ. Романов A.B., Ларионов О.Г., Балашова Е.Ю., Коржов П.Б.// Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т.7. Вып.5. С.719-725
3. Использование хроматографии для изучения адсорбции стабильных наночастиц серебра. Романов А. В., Ларионов О.Г., Ревина A.A. //Международная конференция, посвященная 60-летию ИФХ РАН «Физико-химические основы и высокие технологии в 21 веке». Москва 30 мая - 3 июня 2005.
4. Использование хроматографии для изучения адсорбции стабильных наночастиц серебра. Романов A.B., Ларионов О.Г., Ревина A.A. //Сборник тезисов. Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии». Самара. 3-8 июля. 2005. С.122.
5. Исследование температурной кинетики образования 5-гидроксиметилфурфураля в меде методом ВЭЖХ. Романов A.B.,
Ларионов О.Г., Коржов П.Б., Гришковский Б.А.// X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии». 2006 г.