научная статья по теме БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АТФАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ TETRASELMIS VIRIDIS Математика
Текст научной статьи на тему «БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АТФАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ TETRASELMIS VIRIDIS»
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 447, № 5, с. 571-574
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АТФазной АКТИВНОСТЬЮ,
В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ МОРСКОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ TETRASELMIS VIRIDIS © 2012 г. Д. А. Маталин, М. И. Азаркович, Л. Г. Попова, Ю. В. Балнокин
Представлено академиком Л.П. Овчинниковым 15.05.2012 г. Поступило 15.05.2012 г.
Большинство клеточных процессов требует согласованного действия нескольких ферментов. Часто эти ферменты ассоциированы в крупные белковые комплексы, временные или постоянные. Такая организация белков увеличивает эффективность, специфичность и скорость реакций, происходящих в живой клетке. Не только белки цитоплазматической фазы, но и многие белки, функционирующие в клеточных мембранах, также входят в состав мультимолекулярных белковых комплексов. Примерами подобных белковых ансамблей являются система окислительного фосфорилирования митохондриальных и бактериальных мембран, АТФсинтазы различных сопрягающих мембран (АТФазы Б-типа), мембранные АТФазы У-типа, белковые суперкомплексы тилакоидных мембран хлоропластов [1]. Белковые ассоциации известны и для плазматической мембраны эукариот. Например, это НАДФН-оксидоредуктаза плазмалеммы животных или растительных клеток [2].
О функционально-активной структуре АТФаз Р-типа в плазматической мембране клеток известно немного. Принято считать, что АТФазы Р-типа в отличие от полипептидных белковых комплексов АТФаз Б- или У-типов имеют простую структуру и являются, как правило, одиночным полипептидом с молекулярной массой, лежащей в диапазоне 90—120 кДа [3]. Между тем для наиболее полно изученной АТФазы этого типа — Ма+,К+-АТФазы животных клеток — хорошо установлено, что этот фермент представляет собой олигомерный комплекс, построенный из субъединиц двух типов: а-липопротеина с молекулярной массой 90—130 кДа и Р-гликопротеина с молекулярной массой 35—57 кДа [4]. Для функциональной активности этого фермента необходимо по меньшей мере наличие димера (аР)2. Катали-
Институт физиологии растений
им. К.А. Тимирязева
Российской Академии наук, Москва
тическую активность проявляет также и белок в форме тетрамера (аР)4. В последнее время все больше данных свидетельствует о том, что и другие АТФазы Р-типа часто представлены олиго-мерными комплексами. Так, например, для Н+-АТФазы растений показано, что она является функционально активной как в мономерной форме, так и в форме гомодимера или гексамера [5].
Галотолерантная микроводоросль Tetraselmis viridis (царство Plantae, отд. Chlorophyta, класс Prasinophyceae) обитает в морской воде, где концентрация NaCl составляет около 0.46 М. В плазматической мембране этой водоросли функционируют по меньшей мере два вида ион-транспор-тирующих АТФаз. Это протонная помпа или H+-АТФаза — фермент, присущий плазматической мембране всех растительных клеток [6], и Na+-помпа — №+-транспортирующая АТФаза [7]. №+-АТФаза как специализированный механизм переноса Na+ через плазматическую мембрану T. viridis является основным механизмом поддержания №+-гомеостаза в цитоплазме у этого организма. Как Н+-АТФаза, так и №+-АТФаза T. viridis относятся к классу АТФаз Р-типа [8].
Отправной точкой данного исследования послужило предположение, что АТФазы плазматической мембраны микроводоросли T. viridis могут входить в состав белковых комплексов (го-мо- или гетероолигомерных). В частности, полученные ранее данные кинетических исследований Na+-АТФазы T. viridis позволяют предположить, что этот фермент функционирует в мембране в виде гомоолигомерного комплекса
Одним из способов исследования мультимоле-кулярных белковых комплексов является голубой нативный электрофорез (Blue Native Electrophoresis, BNE). Этот метод был разработан для анализа мультимолекулярных комплексов мембранных белков, в частности, для исследования ферментной системы окислительного фосфори-лирования митохондрий [10]. При голубом на-
120 100 80 60 40
Рис. 1. Влияние некоторых ингибиторов мембранных АТФаз на скорость гидролиза АТФ препаратами ПМ T. viridis при двух значениях рН реакционной смеси, соответствующих оптимумам работы Н+-АТФазы и №+-АТФазы T. viridis. Ингибиторы в стандартной реакционной смеси в различных вариантах опыта: 1 — контроль, 2 — 50 мМ KNO3 (ингибитор АТФаз V-ти-па), 3 — 1 мМ NaN3 (ингибитор АТФаз F-типа), 4 — 10 мМ Na2MoO4 (ингибитор неспецифических фос-фатаз), 5 — 0.1 мМ дициклогексилкарбодиимид (ингибитор АТФаз различного происхождения), 6 — 0.1 мМ ортованадат (высокоспецифичный ингибитор АТФаз Р-типа). АТФазная активность в контроле составляла 10—12 мкмоль Рн на 1 мг белка в 1 ч. Приведены средние значения по трем независимым экспериментам и стандартные отклонения.
тивном электрофорезе белки и белковые комплексы сохраняют свою нативную структуру и функционально-активное состояние, поскольку в этом методе для дезинтеграции мембран и со-любилизации белков применяются мягкие неионные детергенты (додецил мальтозид, дигито-нин, тритон Х-100). Последние нарушают липид-липидные и липид-белковые взаимодействия в мембранах, сохраняя, однако, нативные белковые комплексы. Электрофоретическую подвижность белкам в методе BNE обеспечивает анионный краситель кумасси голубой G-250, который связывается с белками и придает им суммарный отрицательный заряд. Электрофоретическое разделение белков и белковых комплексов происходит в соответствии с их молекулярными массами. Этот метод мы применили в данной работе для поиска предполагаемых белковых комплексов плазматической мембраны T. viridis, содержащих в своем составе АТФазу/АТФазы.
Выращивание морской микроводоросли T. viridis в среде, содержащей 0.46 М NaCl и необходимые биогенные элементы, а также получение из
клеток этой водоросли фракции плазматических мембран осуществляли согласно методам, описанным ранее [11]. Идентификацию комплексов мембранных белков осуществляли методом голубого нативного электрофореза (BNE) в градиентном полиакриламидном геле (ПААГ) согласно [10]. Градиент пористости гелей составлял 4—13%. Перед нанесением на гель мембраны солюбили-зировали согласно процедуре, описанной в работе [12], в буфере следующего состава: 30 мМ HEPES, 150 мМ CH3COOK, 10%-й (в/о) глицерин, 5%-й (в/о) дигитонин, 0.01 мг/мл фенилме-тилсульфонилфторида (ингибитор протеаз), pH 7.4. Суспензию мембран инкубировали в этом буфере 30 мин при 0°С. Перед нанесением на гель к суспензии солюбилизированных мембран добавляли кумасси G-250 и аминокапроновую кислоту (конечные концентрации составляли 0.5% и 75 мМ соответственно). Электрофорез проводили при постоянном напряжении 100 В, 16 ч при 4°С. После того, как окрашенный фронт проходил 1/3 длины разделяющего геля, синий катодный буфер, содержащий кумасси G-250, заменяли неокрашенным буфером.
Обнаружение белковых комплексов, обладающих АТФазной активностью, в гелях in situ осуществляли согласно методу, основанному на образовании в присутствии АТФ и Pb(NO3)2 нерастворимого осадка фосфата свинца в участках геля, содержащих АТФазу в нативном состоянии [13]. Непосредственно после нативного электрофореза белков полоски геля вырезали и инкубировали в соответствующем буфере (при комнатной температуре в течение 4 ч). Буфер для обнаружения АТФазной активности в геле имел следующий состав: 35 мМ Tris/MES, 270 мМ глицин, 10 мМ MgSO4, 0.2%-й (в/о) Pb(NO3)2, 8 мМ АТФ; рН 6.5 (оптимум работы Н+-АТФазы) или pH 7.8 (оптимум работы №+-АТФазы). В варианте для обнаружения активности №+-АТФазы (pH 7.8) в раствор дополнительно вносили 100 мМ NaNO3. Контрольный вариант не содержал NaNO3.
АТФ-гидролазную активность мембранных фракций регистрировали по высвобождению неорганического фосфата, концентрацию которого в реакционной смеси определяли согласно методу [14]. Стандартная реакционная смесь для определения АТФ-гидролазной активности содержала следующие компоненты: 25 мМ MES/BTP буфер, рН 6.5 или 7.8, 1 мМ Ш2АТФ, 2 мМ MgSO4, 0.1 мМ EGTA, 10 мкг мембранного белка. Реакцию начинали добавлением АТФ.
Для доказательства чистоты получаемой фракции плазматической мембраны был проведен инги-биторный анализ ее АТФазной активности (рис. 1). Из всех проверенных ингибиторов существенно подавлял АТФазную активность только ортова-надат — специфический ингибитор АТФаз Р-ти-
па. Результаты ингибиторного анализа показали, что получаемые фракции содержат плазматическую мембрану, практически свободную от примесей других клеточных мембран, и соответственно АТФазная активность получаемых мембранных фракций обусловлена работой АТФаз Р-типа.
На рис. 2 представлены результаты экспериментов, в которых было осуществлено электро-форетическое разделение белков/белковых комплексов плазматической мембраны T. viridis методом BNE, и в гелях in situ обнаружены белковые комплексы, обладающие АТФазной активностью. Поскольку было показано, что в исследуемой мембранной фракции АТФазная активность обусловлена работой АТФазы/АТФаз Р-типа (рис. 1), то очевидно, что обнаруженная в гелях АТФазная активность также обусловлена функционированием АТФаз Р-типа. В зависимости от варианта опыта АТФазная активность обнаруживается в разных областях геля.
В геле, который инкубировали в кислом буфере (рН 6.5), обнаруживалась АТФазная активность в области белков, молекулярная масса которых лежит в диапазоне от 100 до 140 кДа (рис. 2, дорожка 2) (дана приблизительная оценка молекулярной массы с учетом того, что электрофорез белков проходил в градиентном ПААГ). Эта активность проявлялась при отсутствии ионов Na+ в реакционной смеси и, вероятно, обусловлена работой протонной помпы, Н+-АТФазы. Ранее было показано, что этот фермент функционирует в плазмалемме T. viridis, и что его максимальная активность наблюдается при рН 6.5—7.0 [8]. АТФазная активность протонной помпы обнаруживается в двух близко расположенных областях геля. Последнее можно объяснить, исходя из предположения, что Н+-АТФаза T. viridis активна как в форме индивидуального белка ("легкая" полоса), так и в комплексе с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.